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色谱柱的选择

阅读次数:3320    发布时间:2016/2/28 16:28:17

现代高效液相色谱中,分离效果好坏很大程度上取决于对色谱填料的选择。但是色谱填料的选择范围很宽,要做合适的选择,必须对此有一定的认识和了解。
 
1、正相色谱
正相色谱用的固定相通常为硅胶(Silica),以及其他具有极性官能团,如胺基团
(NH2,APS)和氰基团(CN,CPS)的键合相填料。
  
由于硅胶表面的硅羟基(SiOH)或其他团的极性较强,因此,分离的次序是依据样品
中的各组份的极性大小,即极性强弱的组份最先被冲洗出色谱柱。
正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低,如:正乙烷(Hexane),氯仿
(Chloroform),二氯甲烷(Methylene  Chloride)等。

 

2、反相色谱
反相色谱填料常是以硅胶为基础,表面键合有极性相对较弱的官能团的键合相。
反相色谱所使用的流动相极性较强,通常为水,缓冲液与甲醇,已腈等混合物。
样品流出色谱柱的顺序是极性较强组合最先被冲出,而极性弱的组份会在色谱柱上有
更强的保留。
常用的反相填料有C18(ODS)、C8(MOS)、C4(B)、C6H5(Phenyl)等。
 
二、聚合物填料
聚合物调料多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等,其主要优点是在PH值为1~
14均可使用。
相对与硅胶基质的C18填料,这类填料具有更强的疏水性;大孔的聚合物填料对蛋白
质等样品的分离非常有效。
现在的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料,色谱柱柱效较低。
 
三、其他无机填料
其它HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化。由于其特殊的性质,一般仅限于特殊的
用途。如石墨化碳也用于正逐渐成为反相色谱填料。这种填料的分离不同与硅胶基质烷基
键合相,石墨化碳的表面即是保留的基础,不再需其它的表面改性,该柱填料一般比烷基
键合硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强,石墨化碳可用于分离某些几何导构体,又由
于HPLC流动相中不会被溶解,这类柱可在任何PH与温度下使用。氧化铝也可用于HPLC,
氧化铝微粒刚性强,可制成稳定的色谱柱柱床,其优点是可在PH高达12的流动相中使用。
但由于氧化铝与碱性化合物作用也很强,应用范围受到一定的限制,所以未能广泛应用,
新型氧化锆填料也可用于HPLC,商品化的仅有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱,应
用PH范围1~14,温度可达100℃。由于氧化锆填料几年才开始研究,加之面临的实验难
度,其重要用途与优势尚在进行中。
 
四、怎样选择填料粒度
 目前,商品化的色谱料粒度从1um到超过30um均有销售,而目前分析分离主要用3um、
5um和10um填料,填料的粒度主要影响填充柱的两个参数,即柱效和背压。粒度越小,填
充柱的柱效越高;小于3um的填料应用,在相同选择性条件下,提高柱效可提高分离度,
但不是唯一的因素。如果固定相选择是正确,但是分离度不够,那么选择更小粒度的填料
是很有用的,3um填料填充柱的柱数比相同条件下的5um填料的柱效提高近30%;然而,
3um的色相谱的背压却是5um的2倍。与此同时,柱效提高意味着在相同条件下可以选择更
短的色谱柱,以缩短分析时间,另外,可以采用低粘度的溶剂做流动相或增加色谱柱的使
用温度,比如用乙腈代替甲醇,以降低色谱柱的压力。
 
一、如何保证良好的柱性能与柱寿命
◆ 认证阅读色谱柱使用说明书;
◆ 使用填充良好的色谱柱;
◆ 尽量减少压力波动,避免机械及热冲击;
◆ 使用保护柱及在线过滤器;
◆ 经常以强溶剂冲洗色谱柱;
◆ 充分过滤样品及流动相,尽量避免杂质微粒与强保留成分;
◆ 用稳定的固定相(C18最稳定);
◆ 在中等PH值操作(6~8),用有机缓冲溶液;
◆ 色谱柱使用温度最好小于40℃;
◆ 硅胶基质的的色谱柱,应保持流动相的PH值范围在3.0~8.0;
◆ 在水流动相与缓冲溶液中加200ppm的叠氮钠;
◆ 流动相中含有缓冲溶液,应注意应95∶5的水及有机溶剂过渡,有机溶剂不能低于5%;
◆ 过夜或贮存时,冲洗掉盐和缓冲液,用纯有机溶剂流动相保存(乙晴最好)。

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